測(cè)量綠色植物組織或器官中葉綠素含量的方法
來源： http://www.pfyin.com/ 類別：實(shí)用技術(shù) 更新時(shí)間：2013-05-14 閱讀次
【本資訊由中國糧油儀器網(wǎng)提供】 測(cè)量綠色植物組織或器官中葉綠素含量的原理：根據(jù)葉綠家對(duì)可見光的吸收光譜，利用分光光度計(jì)在某一特定波長下測(cè)定其吸光度，而后公式計(jì)算葉綠素含量。
根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光皮A應(yīng)與其濃度c和液層厚度L成比例，即：
A＝KCL
式中l(wèi)x為比例常數(shù)，當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，K為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的比吸收系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長的吸光值而求得。
如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。如欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b、葉黃素、胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在3個(gè)特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光應(yīng)選擇葉綠索在紅光區(qū)的最大吸收峰。
儀器設(shè)備：1.分光光度計(jì)：1臺(tái)；葉綠素檢測(cè)儀：1臺(tái)。2.研缽：1臺(tái).3.員簡(jiǎn)：1個(gè)。4.剪刀：1把。5.50mL量瓶：1個(gè)。6.玻璃棒。7.1cm漏斗：1個(gè)。8.7cm濾紙：1張。9.滴管：1支。試劑：80％丙酮。材料：任何綠色植物組織或器官。
測(cè)量綠色植物組織或器官中葉綠素含量的方法步驟：
（一）研磨法玻璃棒。
7cm濾紙：1張。
1.取樣、剪碎、混勻，然后稱取新鮮樣品1.18g。
2.樣品置研缽中，加少量CaC03和石英砂及0.5mL純丙酮研成勻漿，再加80％丙酮10mL繼續(xù)研磨至組織變?yōu)榘咨?BR> 3.取濾紙一張，放入漏斗中用80％丙酮濕潤，把提取液倒入漏斗中，濾入25mL量瓶里，用少量丙酮沖洗研體數(shù)次，最后連殘?jiān)鸬谷寺┒贰?BR> 4.用滴管吸取80％丙酮，一滴一滴的將濾紙上的叫綠家提取液全部洗入量瓶內(nèi)，直到濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。最后用80％丙酮定容至25mL。
5.把葉綠體色素提取液倒人光徑1cm的比色杯內(nèi)，分光光度計(jì)分別在波長645nm、663nm和652nm下測(cè)定吸光度，以80％丙酮為空白對(duì)照，并于葉綠素檢測(cè)儀的測(cè)量值進(jìn)行對(duì)比分析。
6.分別計(jì)算葉綠素)a、b)和葉綠素的總濃度(mg/L)，若用96％乙醇，需在波長665nm、649nm和470nm下測(cè)定吸光度，則計(jì)算葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量，相加即得葉綠素總濃度。
7.求得色素濃度后冉按下式計(jì)算組織中各色家含量(用mg•g“鮮重或干重表水)式中，C：葉綠體色素的濃度(mg/L)小w：鮮重(g)lv：提取液總體積(ml)；稀釋倍數(shù)。
（二）直接浸提法
1.將新鮮小麥M1片剪成0.2cm左方的細(xì)絲或小塊混合均勻后.稱取0.10—0.20825mL容量瓶或具塞刻度試管中。
2在容量瓶或試管中加入0.5mL純丙酮和10—15mL80％的丙酮，并仔細(xì)將就附在瓶壁邊緣的葉片碎末洗到丙酮溶液中去，蓋上瓶塞，室溫下置暗處浸提過夜4其間搖動(dòng)3—4次。
3.次日取出容量瓶，觀察nl組織巳全部交白時(shí)，表示葉綠素已浸提干凈，然后用80％丙酮定容至25mL刻度，過濾或離心后，與研磨法同樣進(jìn)行比色測(cè)定。
（三）注意事項(xiàng)：
1.為了避免葉綠素的光分解，操作應(yīng)在弱光進(jìn)行。并盡可能縮短研磨時(shí)間2min為宜。
2.克接浸提法也可采用丙酮一乙醇—水混合液，其配制比例為：純丙酮：無水乙醇：蒸餾水。
3.若是干材料，可經(jīng)研磨過篩后，稱取0.10g左右、與鮮樣同法浸提(但不用加0.5mL純丙酮)。
4.用分光光度法測(cè)定葉綠體色素含量，對(duì)分光光度計(jì)本身的精確性要求較高，分光光度計(jì)在使用前需對(duì)波長進(jìn)行校正。校正的方法除按儀器說明校正外，還應(yīng)以純的葉綠素a和b來校正。因?yàn)榧词褂脟a(chǎn)儀器中性能較好的7200型分光光度計(jì)，經(jīng)校正后在660-700nm波段中的讀數(shù)誤差還可能有12nm，這對(duì)測(cè)定葉綠索a，b值已有影響，具體校正步驟可參照參文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行。
根據(jù)朗伯—比爾定律，某有色溶液的吸光皮A應(yīng)與其濃度c和液層厚度L成比例，即：
A＝KCL
式中l(wèi)x為比例常數(shù)，當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位，液層厚度為1cm時(shí)，K為該物質(zhì)的比吸收系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長下的比吸收系數(shù)可通過測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長的吸光值而求得。
如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。如欲測(cè)定葉綠體色素混合提取液中葉綠素a、b、葉黃素、胡蘿卜素的含量，只需測(cè)定該提取液在3個(gè)特定波長下的吸光度A，并根據(jù)葉綠素a、b及類胡蘿卜素在該波長下的比吸收系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b時(shí)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光應(yīng)選擇葉綠索在紅光區(qū)的最大吸收峰。
儀器設(shè)備：1.分光光度計(jì)：1臺(tái)；葉綠素檢測(cè)儀：1臺(tái)。2.研缽：1臺(tái).3.員簡(jiǎn)：1個(gè)。4.剪刀：1把。5.50mL量瓶：1個(gè)。6.玻璃棒。7.1cm漏斗：1個(gè)。8.7cm濾紙：1張。9.滴管：1支。試劑：80％丙酮。材料：任何綠色植物組織或器官。
測(cè)量綠色植物組織或器官中葉綠素含量的方法步驟：
（一）研磨法玻璃棒。
7cm濾紙：1張。
1.取樣、剪碎、混勻，然后稱取新鮮樣品1.18g。
2.樣品置研缽中，加少量CaC03和石英砂及0.5mL純丙酮研成勻漿，再加80％丙酮10mL繼續(xù)研磨至組織變?yōu)榘咨?BR> 3.取濾紙一張，放入漏斗中用80％丙酮濕潤，把提取液倒入漏斗中，濾入25mL量瓶里，用少量丙酮沖洗研體數(shù)次，最后連殘?jiān)鸬谷寺┒贰?BR> 4.用滴管吸取80％丙酮，一滴一滴的將濾紙上的叫綠家提取液全部洗入量瓶內(nèi)，直到濾紙和殘?jiān)袩o綠色為止。最后用80％丙酮定容至25mL。
5.把葉綠體色素提取液倒人光徑1cm的比色杯內(nèi)，分光光度計(jì)分別在波長645nm、663nm和652nm下測(cè)定吸光度，以80％丙酮為空白對(duì)照，并于葉綠素檢測(cè)儀的測(cè)量值進(jìn)行對(duì)比分析。
6.分別計(jì)算葉綠素)a、b)和葉綠素的總濃度(mg/L)，若用96％乙醇，需在波長665nm、649nm和470nm下測(cè)定吸光度，則計(jì)算葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量，相加即得葉綠素總濃度。
7.求得色素濃度后冉按下式計(jì)算組織中各色家含量(用mg•g“鮮重或干重表水)式中，C：葉綠體色素的濃度(mg/L)小w：鮮重(g)lv：提取液總體積(ml)；稀釋倍數(shù)。
（二）直接浸提法
1.將新鮮小麥M1片剪成0.2cm左方的細(xì)絲或小塊混合均勻后.稱取0.10—0.20825mL容量瓶或具塞刻度試管中。
2在容量瓶或試管中加入0.5mL純丙酮和10—15mL80％的丙酮，并仔細(xì)將就附在瓶壁邊緣的葉片碎末洗到丙酮溶液中去，蓋上瓶塞，室溫下置暗處浸提過夜4其間搖動(dòng)3—4次。
3.次日取出容量瓶，觀察nl組織巳全部交白時(shí)，表示葉綠素已浸提干凈，然后用80％丙酮定容至25mL刻度，過濾或離心后，與研磨法同樣進(jìn)行比色測(cè)定。
（三）注意事項(xiàng)：
1.為了避免葉綠素的光分解，操作應(yīng)在弱光進(jìn)行。并盡可能縮短研磨時(shí)間2min為宜。
2.克接浸提法也可采用丙酮一乙醇—水混合液，其配制比例為：純丙酮：無水乙醇：蒸餾水。
3.若是干材料，可經(jīng)研磨過篩后，稱取0.10g左右、與鮮樣同法浸提(但不用加0.5mL純丙酮)。
4.用分光光度法測(cè)定葉綠體色素含量，對(duì)分光光度計(jì)本身的精確性要求較高，分光光度計(jì)在使用前需對(duì)波長進(jìn)行校正。校正的方法除按儀器說明校正外，還應(yīng)以純的葉綠素a和b來校正。因?yàn)榧词褂脟a(chǎn)儀器中性能較好的7200型分光光度計(jì)，經(jīng)校正后在660-700nm波段中的讀數(shù)誤差還可能有12nm，這對(duì)測(cè)定葉綠索a，b值已有影響，具體校正步驟可參照參文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行。
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