黑豆芽葉綠素含量的研究方法
黑豆芽，并不是我們通常所說的豆芽，比普通的營養(yǎng)成分含量高很多，尤其是里面的葉綠素含量，更是在很多蔬菜中占據(jù)榜首，這些都是經(jīng)過一系列的研究實驗證實，尤其是近代葉綠素儀使用的成熟，使得對黑豆芽中葉綠素的研究更加廣泛，下面我們一起看下黑豆芽的葉綠素含量研究方法。
黑豆芽，俗稱豆苗，口感鮮嫩，營養(yǎng)豐富，富含鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)及多種維生素；而且還具有很高的藥用價值，其性微涼，味甘，有活血利水、清熱消腫、補肝明目的功效。更為重要的是黑豆芽富含葉綠素。葉綠素分子結(jié)構與人體內(nèi)的血液分子相似，非常易溶入紅細胞中，能抑制細菌、排出毒素，有“綠色血液”之稱。
研究表明，豆芽中的葉綠素能分解人體內(nèi)的亞硝酸胺，能夠起到預防直腸癌等多種消化道惡性腫瘤的作用。因此，研究黑豆芽的葉綠素測定提取方法，對于提高其品質(zhì)和黑豆芽葉綠素深度開發(fā)具有重要意義。關于葉綠素含量測定方法使用較多的是Arnon法，但是Arnon法需要把植物材料研磨和去殘渣，提取時間長，工作量和操作誤差大。20世紀80年代初張憲政提出了丙酮乙醇混合液浸提法，證明利用混合液進行葉綠素浸提的可行性，進一步研究后發(fā)現(xiàn)，混合液法比傳統(tǒng)Arnon法提取葉綠素效率高，穩(wěn)定性好，并且洪法水等發(fā)現(xiàn)丙酮與乙醇在等濃度混合時提取效果最好，明華等認為浸提法要優(yōu)于研磨法，混合液浸提葉綠素比單獨用丙酮或乙醇浸提快，葉片冷凍處理后，快速浸提能夠縮短葉綠素浸提時間。目前，關于芽菜葉綠素提取方法鮮見報道，本文以常規(guī)的Arnon法為基礎，對研磨法和混合液浸提法進行了研究以探討黑豆芽葉綠素含量測定方法。
1材料與方法
1.1 材料、儀器、試劑
黑豆芽購于市場；分光光度計：浙江托普糧食儀器；萬分之一天平：托普儀器；丙酮、乙醇：分析純，按體積比配制浸提液：95%乙醇，丙酮∶乙醇=1∶1，80 %丙酮分別用A、B、C 表示。
1.2 方法
預處理樣品，取黑豆芽適量，用紗布或吸水紙吸干表面的水分，將子葉等剪成小于 2 mm 碎條， 混勻，分成2份。提取測量，一份在室溫（25℃）下， 立即用研磨法和直接浸提法（A、B、C 3 種提取液）提取葉綠素。
其中浸提法，稱取1g處理好的樣品置于50mL容量瓶中加入相應提取液，定容，混勻，封口，置于黑暗條件下直接浸提。待組織完全變白，分別在波長663、645、470 nm 下測定吸光度值。另一份用天平精準稱�。�1g，9 份），分別裝袋，密封好，放到冰箱冷凍6h，取出以浸提法測定吸光度值。浸提法、研磨法、冷凍浸提法每個處理各重復3次。
1.3 數(shù)據(jù)處理
葉綠素含量的計算：Ca=12.7A663-2.69A645；式中：Ca為葉綠素a濃度，（mg/L）；Cb=22.9A645-4.68A663；式中：Cb為葉綠素 b 濃度，（mg/L）；C（a＋b）=Ca+Cb；式中：C（a＋b）為葉綠素總濃度，（mg/L）；葉綠素的含量（/mg/g）=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重；所有數(shù)據(jù)處理用SPSS13.0統(tǒng)計軟件完成。
2結(jié)果與分析
2.1 黑豆芽葉綠素含量
各種方法提取結(jié)果見表1。
由表1可見，黑豆芽（不包括胚軸和胚根）葉綠素含量為0.1677mg/g（鮮重），a/b 為2.524。
2.2 不同提取方法的提取效果比較
研磨法、浸提法、冷凍浸提法3種提取方法，對于葉綠素a、b 提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以冷凍浸提法提取效果最好，其次為研磨法，再次為浸提法表2）。
浸提法提取效果最差，一方面可能提取不完全，也可能在提取的過程中葉綠素有分解，相對冷凍浸提法，由于經(jīng)過了冷凍過程破碎了細胞，提取完全而且提取過程快減少了葉綠素分解，效果最好。研磨法在研磨、過濾等操作的過程中有損失，而且提取時間過程長造成弱光下葉綠素的分解，效果不及冷凍浸提法。葉綠素含量提取效果的單變量方差分析，見表3。
由表3單變量方差分析表明，葉綠素 a Sig.=0.749，P>0.05，葉綠素 b Sig.=0 .145，P>0.05，即不同提取方法間差異不顯著。
2.3 不同提取液提取效果
比較不同提取液提取效果比較，見表4。
由表4可見，不同提取液提取效果，對于葉綠素a、b 提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以 95 %乙醇提取效果最好，其次乙醇丙酮 1∶1 混合，再次為 80 %丙酮。由表 2 單變量方差分析表明，葉綠素 a Sig.=0.000，P<0.01，葉綠素b表1 黑豆芽葉綠素含量測量結(jié)果Sig.=0.001，P<0.01，即不同提取液提取效果差異極顯著。進一步進行不同提取液提取效果多重比較分析表明（表5）。
由表5可知，除葉綠素 b 丙酮乙醇 1∶1 混合提取液和 80 %丙酮提取液間差異不顯著，其余各處理間差異顯著。單種提取液 95 %乙醇提取效果最好，與明華等對玉米葉葉綠素提取研究結(jié)論一致，但乙醇丙酮1∶1混合液的提取效果不及 95 %乙醇，又與明華、李得孝結(jié)論不一致。
由表6對95%乙醇提取液的3種方法提取效果比較也可看出，提取黑豆芽葉綠素以95%乙醇為提取液，以冷凍浸提效果最好。
3 結(jié)論與討論
1）研磨法、浸提法、冷凍浸提法3種方法提取黑豆芽葉綠素，對于葉綠素a、b提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以冷凍浸提法提取效果最好，其次為研磨法，再次為浸提法，但不同提取方法間差異不顯著。盡管 3 種方法提取效果差異不顯著，但研磨法工作量大，提取時間長；浸提法提取值偏低；冷凍浸提法速度快且效果好，故在黑豆芽葉綠素提取中可采用冷凍浸提法。
2）3 種提取液提取黑豆芽葉綠素，葉綠素a、b提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以95%乙醇提取效果最好，其次乙醇丙酮1∶1混合液，再次為80%丙酮，且3種提取液提取效果差異極顯著。結(jié)合上文分析黑豆芽葉綠素以95%乙醇為提取液，以冷凍浸提效果最好。
3）本文在冷凍浸提中并未對冷凍處理的時間進行深入研究，在對混合提取液的研究中也僅對乙醇丙酮1∶1 混合比例進行了研究，有學者認為乙醇丙酮1∶2提取效果好等。因此，關于此方面的工作還需進一步研究。
